如何设计引物

1、首先要拿到自己要设计引物的目的基因。这里我使用一段GFP基因给大家讲解。将目的基因保存在txt文档里面，或者直接复制下来后在DNAMAN里面新建文档复制进去。下面是我们要设计引物的GFP基因序列。

2、打开DNAMAN，选择菜单里面的Primer-->Load Primer-->From Input。将上一步中的目的基因序列从开头开始的20个左右的碱基复制粘贴进去(引物长度要在15—30bp之间，常用的是18-27bp)，比如我们先试试前20个碱基是否合适，将ATTGATGTGATATCTCCACT这20个碱基复制粘贴进去，点击OK。

3、再次点击Primer，选择Melting Temperature，打开对话框。这里面可以看到你的碱基序列，个数以及Thermo，也即Tm值，是溶解温度。Tm值一般在55℃到70℃之间比较好，PCR仪的退火温度一般设定比primer的Tm低5℃（不过一般情况我们都设定为55℃，因此Tm值在60左右比较好）。

4、从上图可以看到我们这20个碱基的Tm值只有49度，显然太低，需要增加碱基数量。我们取前24个碱基粘贴进去，点击下方Show Tm便可以看到这个引物的Tm值，发现是60.3度，很合适，就用这个了。这样正向引物就设计完了，把这24个碱基序列保存下来。

5、设计反向引物需要将目的基因序列进行反向互补，然后按照正向引物一样的方法设计便可。反向互补操作可以在DNAMAN里面快速方便进行。打开DNAMAN，选择左侧第一个Channel，然后点击菜单栏的Sequence-->Load Sequence-->From Sequence File…将我们保存目的基因的txt文档导入到软件中。【打开txt文档的时候记得在打开窗口中的文件类型里面选择All Files】

6、可以看到序列被导入到了第一个Channel，双击这个Channel便可以看到我们的序列的详细信息。

7、保持Channel 1选中的状态，选择Sequence-->Display Sequence，打开对话框。

8、选择对话框中的Reverse Complement Seq，其他的复选框都取消。然后点击OK。

9、这样就可以看到目的基因的反向互补序列了。

10、对这个反向互补序列进行和上面设计正向序列引物一样的操作，设计引物便可。具体的不再啰嗦，我直接把我的设计结果告诉大家：选择前24个碱基，也即TCAAAGATCTACCATGTACAGCTC，Tm值为57.6，比较合适。到此引物设计就结束了。拿着刚才设计的正向引物和这里设计的反向引物就可以找公司帮我们合成引物了。